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SNP分型原理及方法介紹
1、技術(shù)原理
首先通過PCR擴(kuò)增含有SNP的基因[1]組片段，然后通過序列特異性引物實(shí)現(xiàn)單堿基延伸，隨后樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在真空管中受瞬時(shí)納秒 (10-9s) 強(qiáng)激光激發(fā)。核酸分子因此解吸附成為單電荷離子，由于電場中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的分子量，從而檢測出SNP位點(diǎn)信息。
2、主要特點(diǎn)
時(shí)間飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF）完成的SNP檢測準(zhǔn)確率可達(dá)99.9%，除了準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)、通量大、檢測周期短等優(yōu)勢外，zui有吸引力的應(yīng)該還是它的性價(jià)比。飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)（MALDI-TOF）是通用的基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的研究平臺(tái)，該方法憑借其科學(xué)性和準(zhǔn)確性已經(jīng)成為該領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。
3、主要方法
1. TaqMan探針法
針對(duì)染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。探針的5’-端和3’-端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)溶液中存在PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。
2. SNaPshot法
該技術(shù)由美國應(yīng)用生物公司（ABI）開發(fā)，是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱小測序，主要針對(duì)中等通量的SNP分型項(xiàng)目。在一個(gè)含有測序酶、四種熒光標(biāo)記ddNTP、緊臨多態(tài)位點(diǎn)5’-端的不同長度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)ABI測序儀檢測后，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。對(duì)于PCR產(chǎn)物模板可通過多重PCR反應(yīng)體系來獲得。通常用于10-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析。
3. HRM法
高分辨率熔解曲線分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。該方法無需設(shè)計(jì)探針，操作簡便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。