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GST融合蛋白純化常見問題解答
一、GST融合蛋白
GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）能特異的與谷胱甘肽結(jié)合，表現(xiàn)為酶和底物的作用原理，利用這個原理，將GST做成標(biāo)簽表達(dá)出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質(zhì)特異性結(jié)合，從而純化出目標(biāo)蛋白，GST融合蛋白純化的特點(diǎn)有：純度高、純化條件溫和保持蛋白活性、促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)等。
二、GST蛋白結(jié)合效率太低
1.可能原因：上樣流速太快，結(jié)合時間太短
解決方案：GST親和層析是利用GST (glutathione-S-transferase )融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價親和結(jié)合，GST與谷胱甘肽的結(jié)合相對緩慢，比金屬螯合親和層析純化his蛋白結(jié)合要緩慢很多。上樣流速太快，會影響結(jié)合效率。GST親和層析時流速適當(dāng)減慢，保證足夠的結(jié)合時間。
2.可能原因：緩沖液不合適，柱子平衡不到位
解決方案：GST親和層析時緩沖液的pH應(yīng)控制在6.5到8.0的之間，并保證足夠的平衡體積數(shù)，讓填料處于可以使用的狀態(tài)，一般平衡10個柱床體積。
3.可能原因：樣品中GST融合蛋白濃度太低
解決方案：因GST層析時，GST融合蛋白豐度太低時影響結(jié)合效率。對于低豐度的樣品應(yīng)先濃縮，在層析純化?；蛘哌x則匯研生物的高載量GST-4FF填料。
4.可能原因：GST蛋白發(fā)生變性或聚集
解決方案：
1）胞內(nèi)表達(dá)的蛋白在細(xì)胞破碎時應(yīng)選則合適的破碎方式，避免蛋白碳化或者變性。
2）發(fā)生聚集可以嘗試添加1-10mM的DTT，促進(jìn)蛋白的溶解。
3）GST蛋白和核酸結(jié)合或者蛋白之間結(jié)合，可以適當(dāng)?shù)奶砑勇然c（100-300mM)
三、GST蛋白洗脫困難
1.可能原因：洗脫強(qiáng)度不夠
解決方案：
1）增加洗脫體積數(shù)。
2）一般使用中建議的10mM濃度對于大多數(shù)應(yīng)用來說足夠了，但是也存在例外。可以嘗試使用50mM Tris-HCl，20-40mM 還原型谷胱甘肽，pH8.0作為洗脫緩沖液。
3）洗脫緩沖液pH過低時，應(yīng)調(diào)整pH到8-9.
4）洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度不宜太低，應(yīng)控制在100-300mM氯化鈉濃度。
2.可能原因：非特異性吸附
解決方案：洗脫緩沖液中加入1%的TritonX-100或2%的可以顯著提高某些GST標(biāo)簽蛋白的洗脫，降低非特異性吸附和蛋白之間的吸附。
3.可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了
解決方案：洗脫緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用，GTH務(wù)必使用時在加入緩沖液中，也可嘗試加入1-5mM的DTT。
四、GST蛋白純化后純度太低
1.可能原因：GST融合蛋白降解
解決方案：
1）層析體系中加入蛋白酶抑制劑,防止標(biāo)簽蛋白降解。
2）GST標(biāo)簽部分脫落，檢查序列，在宿主細(xì)胞表達(dá)的過程，宿主細(xì)胞代謝的酶使GST-tag和目的蛋白分開，此時可嘗試換宿主細(xì)胞或者優(yōu)化序列。
2.可能原因：輔助表達(dá)的蛋白被表達(dá)
解決原因：一些蛋白的表達(dá)常常需要其它蛋白輔助表達(dá)，如分子伴侶等。一些從這些共純化的蛋白中分離GST標(biāo)簽蛋白的方法已經(jīng)發(fā)表。如：DnaK，有報道這種相互作用可以通過上樣前在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4，pH7.4中37°C溫浴10分鐘而破壞。或者通過ATP-agarose或相似的純化介質(zhì)或進(jìn)行離子交換層析來除去。
五、GST蛋白的表達(dá)
1)采用RT-PCR 擴(kuò)增得到目的基因，構(gòu)建到表達(dá)載體（PGEX-4T-1）上； 2)用構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，LB 平板37℃；
3)LB 平板上挑取單一菌落接入5mL LB 培養(yǎng)基（100ug/mL Amp）中，37℃培養(yǎng)3~5h； 4)將5mL 菌液接入1L LB（100ug/mL Amp）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入0.3mmol/L 的IPTG，
5)20℃誘導(dǎo)16h；
6)將培養(yǎng)好的菌液于5000r/min 離心10min，棄去上清液，收集菌體，離心后菌體沉淀懸浮 于25mL Binding buffer 中。