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【實驗安全處置篇】免疫組化中的染色劑

來源:武漢博歐特生物科技有限公司   2025年04月09日 10:26  

【實驗安全處置篇】免疫組化中的染色劑

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免疫組化在臨床及病理診斷中已廣泛應用,對疾病的判定、鑒別診斷及判定疾病的預后及臨床醫(yī)師對疾病的治療具有重要的指導意義。其在蛋白抗原的細胞準確定位上是其他蛋白檢測方法無法相比的。
免疫組化的基本操作異常結果分析我們在之前的文章中已經(jīng)和大家分享過了,今天我們主要來說一說免疫組化中經(jīng)常用到的“底物和染色劑”!
對于辣根過氧化物酶來說,我們常規(guī)用DAB(二氨基聯(lián)苯胺)或AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色。
DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色劑
DAB(二氨基聯(lián)苯胺)通常作為過氧化物酶最敏感、*常用的顯色底物。細胞顆粒中的過氧化物酶,能將過氧化氫中的氧釋放出來,氧化二氨基聯(lián)苯胺,形成棕黃色沉淀而定位于過氧化物酶活性的部位。反應產(chǎn)物不溶于水、二甲苯和醇,因而適用于多數(shù)復染劑和封片劑。
在DAB顯色后,還可以使用溶于乙醇的染料進行后續(xù)染色??膳浜螪AB染色使用的復染方法包括亞甲基藍、甲基綠和蘇木精。
另外因為其電子密度高,可用于電子顯微鏡觀察。還可以通過用硫酸鎳或氯化鉆進行后處理,可以產(chǎn)生更好的對比度。


左:人乳腺纖維瘤組織的免疫組織化學染色anti-CD206 (Biorbyt,dilution at 1:100)   

右:小鼠皮膚組織的IHC-P染色anti-CD45 (Biorbyt,dilution at 1:100)



但是DAB屬于聯(lián)苯胺類化合物(BZC)中的一種,現(xiàn)已被證實具有免疫毒性、生殖毒性、遺傳毒性、致癌性等毒性,尤其對泌尿系統(tǒng)可致膀胱癌,被國際癌癥研究中心(IARC)確認為致癌物。如果用DAB,液體配制應在通風櫥內(nèi)進行,操作者應戴口罩和手套。一般認為工作液危害較??;但粉劑危害較大。除使用過程中要特別注意安全防護外,使用后的廢液存放和去毒性處理也應引起高度重視。


在我國由于實驗室比較分散,單個實驗室產(chǎn)生的廢液量較少,很少受到實驗使用人員和有關部門的重視,大多實驗室都是未經(jīng)任何處理直接排入下水道,這種情況下日積月累、積少成多也是非??膳碌?。為保護環(huán)境,減少污染,每個使用DAB的實驗室應當把DAB廢液的去毒性處理制定成一項實驗室守則,嚴格執(zhí)行。


DAB的毒性處理原則是DAB分子-全被破壞且反應副產(chǎn)物和終產(chǎn)物也必須不具備誘變性。一直被沿用至今的是“硫酸-高錳酸鉀法”,DAB被處理后不但分子被*全破壞,反應終產(chǎn)物也無誘變性,處理后可以按普通實驗室廢液處置。具體處理步驟如下


1 硫酸-高錳酸鉀水溶液的配制

a.0.2 M高錳酸鉀水溶液:高錳酸鉀31.6 g,蒸餾水1000 ml;


b.2.0M的硫酸水溶液:濃硫酸112 ml,蒸餾水1000 ml。


2 收集廢棄DAB液     包括顯色后洗片、洗器皿的自來水和剩余的DAB顯色液,稀釋后DAB的濃度不超過0.9 mg/ml。



3 去毒性反應    廢棄DAB液每10 ml加入上述5 mla液和5 mlb液,混合后靜置不低于10 h或過夜,此時DAB的致癌性基本解除。



4 脫色     加入抗壞血酸或草酸脫色,邊加邊攪拌至廢液退至無色。



5 中和    加入碳酸氫鈉中和pH值6至8,經(jīng)PH試紙檢測。



6 處理    有廢液回收條件的按普通實驗室廢液回收,沒有回收條件的可以混合大量自來水傾入下水道沖走。

與硫酸-高錳酸鉀法相比,被*認更有效的處理方式是焚燒廢棄物的處置方法,DAB廢棄物加入燃料被焚燒后苯環(huán)*全被破壞,排出的有毒的氮氧化物可以通過洗滌器除去。但焚燒法需要有專業(yè)的回收和存放,較適合集中DAB的毒性處理,而硫酸-高錳酸鉀法較適合實驗室使用。



AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色劑
AEC(3-氨基-9-乙基咔唑),雖然溶于乙醇,因為比DAB致癌危險性低,目前也已經(jīng)應用廣泛。
AEC產(chǎn)生鮮紅色,與用蘇木精復染可形成鮮明的對比。但注意應用不含乙醇的蘇木精,如Mayer,而不用Harris,以避免將溶于乙醇的AEC有色反應產(chǎn)物溶解。
當抗原- 抗體- 酶濃度高時,AEC 可能產(chǎn)生棕黃色產(chǎn)物(AEC有兩個反應位點,當其中一個被轉變時,變成紅色;當兩個都和過氧化物酶反應時,產(chǎn)生棕綠色產(chǎn)物)。pH值為4.8的乙酸緩沖液能減輕這一反應。切片應用水性介質(zhì)(如80%甘油)封片。水性封片劑含有少量有機溶劑,可使染色慢慢溶解或消失。注意不能用乙醇脫水。甘油封片可用指甲油將蓋玻片邊緣密封以長期保存。
其他染色劑還有a-萘酚派若寧(粉色)、4-氯1-茶酚(藍色)和Hanker-Yates 以及大量廣譜染色劑 (見下表1)。反應底物也適用于堿性磷酸酶。有些底物在酶位點上持續(xù)反應,產(chǎn)生顆粒狀有色物質(zhì),從而使堿性磷酸酶系統(tǒng)反應更敏感。但如果反應過度,這些顆粒可能使組織形態(tài)模糊。





參考資料:

[1]陳慶,康維鈞,聯(lián)苯胺類化合物的毒性研究進展.河北醫(yī)科大學學報,2007,28(6):460.

[2]王晉芬,王躍華.DAB廢物處理程序中華病理學雜志,2005,34(12):775.

[3]David J.Dabbs.診斷免疫組織化學[M],第二版,周庚寅,翟啟輝,張慶慧,北京大學醫(yī)學出版社,2008.7:19-20。


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