賽默飛Lipofectamine 2000轉染試劑（貨號11668019）應用全攻略：從入門到精通

一、產品核心優(yōu)勢與應用場景

Lipofectamine 2000是賽默飛世爾推出的明星級陽離子脂質體轉染試劑，廣泛用于DNA/RNA的哺乳動物細胞遞送。其核心優(yōu)勢體現在：

· 高轉染效率：適用于貼壁細胞（HEK293、HeLa）和懸浮細胞（CHO、Jurkat），DNA轉染效率可達85%-95%（數據來源：Thermo Fisher Protocol）

· 低細胞毒性：通過優(yōu)化脂質體結構，48小時培養(yǎng)后細胞存活率≥90%

· 多場景適配：支持質粒DNA、siRNA、miRNA及CRISPR/Cas9系統共轉染

二、標準化操作流程（以24孔板為例）

1. 試劑準備

· 稀釋DNA：需保持無菌環(huán)境，推薦使用Opti-MEM培養(yǎng)基（貨號31985070）將DNA稀釋至0.5-2 μg/μL

· 脂質體混合：Lipofectamine 2000與稀釋液比例為1:25（如：1 μL試劑+24 μL培養(yǎng)基）

2. 復合物形成

· 將脂質體稀釋液與DNA稀釋液按1:1體積混合

· 關鍵步驟：室溫靜置20分鐘，形成穩(wěn)定脂質體-DNA復合物（時間偏差＞5分鐘會導致效率下降10%-15%）

3. 細胞處理

· 貼壁細胞需達到70%-80%融合度

· 每孔加入100 μL復合物，37℃孵育6小時后換液

三、針對不同細胞類型的優(yōu)化策略

四、三大常見問題解決方案

1. 轉染效率低

· 排查方向：DNA純度（OD260/280需在1.8-2.0）、細胞狀態(tài)（傳代次數≤15）

· 優(yōu)化方案：添加增強劑（如PlasmidPlus，貨號A31852）

2. 細胞毒性顯著

· 原因分析：脂質體過量或孵育時間過長

· 改進措施：將轉染時間縮短至4小時，DNA濃度降低30%

3. RNA干擾效率不佳

· 技術要點：siRNA終濃度控制在20-50 nM，推薦使用Silencer Select系列（貨號4392420）

· 驗證方法：設置Cy3標記siRNA對照組，熒光顯微鏡觀察攝取效率

五、高階應用：CRISPR遞送實例

Protocol亮點：

· Cas9質粒與sgRNA質量比采用1:3（如 1 μg : 3 μg）

· 共轉染熒光報告系統（如pEGFP-N1，貨號6085-1）

· 使用流式細胞術篩選后，基因編輯效率提升40%（參考文獻：Nat Methods 2016）

六、保存與質量控制

存儲條件：4℃避光保存，避免反復凍融（凍融超3次活性下降50%）

有效期驗證：開封后6個月內使用，每月進行轉染陽性對照實驗

質控標準：每批次均通過HEK293細胞轉染測試，EGFP表達率≥85%

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