5
當(dāng)前位置：武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司>>技術(shù)文章>>PriCells: 藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法﹠PE-標(biāo)記蛋白A方法
PriCells: 藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法﹠PE-標(biāo)記蛋白A方法
PriCells: 藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法﹠PE-標(biāo)記蛋白A方法
藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法：
1. 巰基化藻紅蛋白（PE）的制備；
（1） 將600μl濃度為15.5mg/ml的鹽酸巰醇亞胺加到1.2ml濃度為3.6mg/ml的PE中；
（2） 將以上混合液和1.2ml pH6.8的PB混合，而后裝入透析袋置入50mmol/L pH6.8的PB中于4℃透析，過夜；
（3） 再換用pH7.5 PB透析6h。每個(gè)PE分子中可結(jié)合8個(gè)巰基；
2. 巰基PE-IgG的制備；
（1） 將30μl濃度為1.1mg/ml的異雙功能試劑SPDP的乙醇溶液，加入到700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50 mmol/L pH7.5），在室溫中反應(yīng)2.5h；
（2） 再將400μl濃度為1.7mg/ml的巰基化PE加到500μl反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h；
（3） 加入50 mmol/L的碘乙酸鈉100μl來封閉殘余巰基，于4℃下用PB透析過夜；
（4） 最后加入0.01%的Na3N3后分裝，于4℃保存半年；
PE-標(biāo)記蛋白A方法：
1. 稱取4.08mg PE溶于1ml濃度為0.1mmol/ml pH7.4的PBS中，溶解后，取出0.5ml，再加入濃度為2.65mg/ml的SPDP無水甲醇液10μl，SPDP/蛋白質(zhì)物質(zhì)的量比為10，22℃反應(yīng)5min，過Sephadex G-50（1×17cm），用100mmol/L pH7.4的PBS平衡和洗脫；
2. 將0.5ml濃度為2mg/ml的蛋白質(zhì)和100mmol/L pH7.4的PBS液混合，把2.6μl上述SPDP甲醇液加入混合液中，使得SPDP：蛋白質(zhì)=9：5，于22℃下放置40min后，再加如25μl pH7.4的二硫蘇糖醇（DTT）緩沖液，于22℃下反應(yīng)25min后，過Sephadex G-50，收集蛋白A峰；
3. 將0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，于22℃下反應(yīng)6h后，將混合物于4℃保存?zhèn)溆茫?/span>
4. 將以上兩種PE標(biāo)記制品溶于0.01mol/L pH7.4 PB（含有0.1mol/L DETA、1mol/L 碘乙酰胺、1%BSA和0.1% NaN3）中，于0—4℃保存；