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定量菌株的菌懸液制作方法

青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司

一、介紹

    細菌個體微小，無法用肉眼直接觀察計數(shù)，而平板上的菌落是數(shù)以億計的細菌集合體。在《中國藥典》及《GB4789.28 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》標準中，進行培養(yǎng)基的質(zhì)量檢驗時，需要用到10-100CFU/mL或其他濃度的定量菌株菌懸液，制作定量菌株菌懸液是微生物實驗技術操作的基本技能之一，通常使用十倍或百倍稀釋法進行制作。

二、稀釋劑的選擇和應用

（1）0.85%生理鹽水或0.9%氯化鈉溶液（在國標中通常使用0.85%生理鹽水，中國藥典中常使用0.9%氯化鈉溶液，二者效果無明顯差別），可適用于絕大多數(shù)細菌或真菌的菌懸液（或孢子懸液）制作。

（2）磷酸鹽緩沖液，與生理鹽水效果接近，可用于菌懸液制備和稀釋，但更常用于樣品的稀釋。

（3）0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，相比較于生理鹽水，此兩種緩沖液對于產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌等厭氧菌的效果更好，更能保持細菌的活性。該培養(yǎng)基因含有少量蛋白胨，細菌易發(fā)生繁殖導致菌數(shù)發(fā)生變化，通常制備的菌懸液需在短時間內(nèi)使用（一般細菌建議在45min內(nèi)使用，厭氧菌建議在15min內(nèi)使用）。

三、操作方法

1.菌液稀釋法

將待稀釋菌接種至非選擇性肉湯培養(yǎng)基中（如金黃色葡萄球菌、沙門細菌可用TSB培養(yǎng)，白色念珠菌、酵母菌可用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)）置于30-35℃或36±1℃過夜培養(yǎng)（真菌可培養(yǎng)48-72h），吸取1mL培養(yǎng)物至9mL生理鹽水中，為10^-1稀釋度，依次往下稀釋，細菌通常在10^-6或10^-7稀釋度可以得到10-100CFU/mL的菌懸液，酵母菌、芽孢菌通常要少做1-2個稀釋度（即10^-5稀釋度左右）。

2.菌苔稀釋法

與菌液稀釋法不同的是，此方法是挑取平板上的菌落進行稀釋。將待稀釋菌接種至非選擇性平板上（一般細菌常用TSA，真菌常用SDA或PDA）培養(yǎng)至菌落生長合適大小，用接種環(huán)挑取直徑2-3mm的單個菌落（若菌落較小，可多挑幾個菌落）至9mL生理鹽水中制成菌懸液，為10-1稀釋度，用十倍或百倍稀釋法往下稀釋，通常在10-7稀釋度左右可以得到10-100CFU/mL的菌懸液，酵母菌、芽孢菌通常要少做1-2個稀釋度。

與菌液稀釋法相比，此方法稀釋得到的菌液濃度更容易控制，可以更好的精準控制在范圍內(nèi)，而且得到的菌懸液活性較為一致。菌液稀釋法相對而言，偏差更大，制成的菌懸液有時會出現(xiàn)細菌活性有差別（在平板上表現(xiàn)為菌落大小不一），但該方法對新手而言，更容易操作。

3.霉菌的孢子懸液制作

將霉菌接種至沙氏瓊脂（或馬鈴薯葡萄糖瓊脂）斜面（或平板）進行培養(yǎng)至產(chǎn)豐富的孢子，加入稀釋劑進行洗脫（也可用接種環(huán)直接挑取一環(huán)孢子至稀釋液中），再用十倍或百倍稀釋法制成適宜濃度菌懸液。

注：（1）培養(yǎng)過程中不可密封培養(yǎng)，保持良好的透氣性有利于霉菌的生長和產(chǎn)孢子；（2）不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)存在差別，霉菌生長后期，培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)逐漸耗盡后，霉菌傾向于開始產(chǎn)孢子，因此在培養(yǎng)過程中不同培養(yǎng)基產(chǎn)孢子時間存在差異；（3）孢子容易在空氣中漂浮擴散，因此若采用接種環(huán)挑取孢子時，應做好防擴散污染的措施。

4.芽孢懸液制作

將芽孢菌接種至硫酸錳營養(yǎng)瓊脂（或其他產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基）36±1℃培養(yǎng)5-7天（或其他合適溫度培養(yǎng)），刮取菌苔至稀釋液中制成懸液，將菌懸液置于65℃中水浴30min（或沸水浴10min）殺死菌體，再用十倍稀釋或百倍稀釋法制成適宜濃度的芽孢懸液。

注：制備好的菌懸液原則上應現(xiàn)制現(xiàn)用（一般應在45min內(nèi)使用，厭氧菌應在15min或更短時間內(nèi)使用，時間過久菌數(shù)會有較大變化），孢子懸液、芽孢懸液相對比較穩(wěn)定，可以在2-8℃保存較長時間，可在經(jīng)過驗證的期限內(nèi)使用。