本快速指南提供了 Covaris 8 AFA-TUBE TPX 條 (PN 520292) 和 96 AFA-TUBE TPX 板 (PN 520291) 消耗品的細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)提取方案，使用三種 Covaris 聚焦超聲儀儀器：ML230、LE220-plus 和LE220Rsc。
本快速指南中提到的值為標(biāo)稱值。公差如下：
• 溫度：± 3 °C
• 樣品體積： - 8 AFA-TUBE TPX 試紙條：± 2.5 µl - 96 AFA-TUBE TPX 板：± 2.5 µl
• 水位：± 1 mm
樣品指南
• 輸入：適用于 8 個(gè) AFA-TUBE TPX 條和 96 個(gè) AFA-TUBE TPX 板
• 福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 卷軸 - 最大 10 µm x ~ 500 mm2
• < 5 mg 新鮮冷凍組織
• 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ( 1,000 至 100,000)
• 緩沖液：組織裂解緩沖液 (TLB) (PN 520284)
• 警告：請(qǐng)勿使用 AFA-TUBE TPX 條或板進(jìn)行長期樣品儲(chǔ)存。樣品應(yīng)在處理后轉(zhuǎn)移。
儀器設(shè)置 • 請(qǐng)參閱特定儀器手冊(cè)以了解完整設(shè)置。
• AFA-TUBE TPX 條和板具有與每種儀器相關(guān)的特定機(jī)架。
FFPE 卷軸實(shí)驗(yàn)方案 使用組織裂解緩沖液處理 FFPE 卷軸的說明。
• 在每個(gè)測(cè)試孔中加載約10 µm x 約500 mm2 FFPE 卷軸。
• TLB 的建議體積為 100 µl，但可根據(jù)卷軸尺寸在 75 至 150 µl 之間更改。在每個(gè)測(cè)試孔中加載 100 µl 組織裂解緩沖液。確保卷軸全浸沒在組織裂解緩沖液中。
• 脫蠟： - 使用下面 AFA 設(shè)置表中描述的“乳化"AFA 條件處理測(cè)試孔。
• 解交聯(lián)： - 將AFA-TUBE TPX 板或條放入設(shè)定為90 °C 的熱循環(huán)儀中90 分鐘。
• 均質(zhì)化： - 使用下頁 AFA 設(shè)置表中描述的“均質(zhì)化"AFA 條件處理測(cè)試孔。此時(shí)可以分析蛋白質(zhì)提取。將 AFA-TUBE TPX 耗材以 3,000 x g 離心 5 分鐘（平板）或 5000 x g 離心 5 分鐘（條帶）。除去上清液并將其用于定量（BCA 測(cè)定）和/或定性分析（SDS-PAGE）。請(qǐng)參閱附錄 A：蛋白質(zhì)提取驗(yàn)證了解更多信息。
組織裂解方案 使用組織裂解緩沖液處理組織的說明。 • 將最多5 mg 的組織裝入每個(gè)測(cè)試孔中。 • 在每個(gè)測(cè)試孔中加載75 µl 組織裂解緩沖液。確保組織全浸沒在組織裂解緩沖液中。 • 均質(zhì)化： - 使用下頁 AFA 設(shè)置表中描述的“均質(zhì)化"AFA 條件處理測(cè)試孔。此時(shí)可以分析蛋白質(zhì)提取。將 AFA-TUBE TPX 耗材以 3,000 x g 離心 5 分鐘（平板）或 5000 x g 離心 5 分鐘（條帶）。除去上清液并將其用于定量（BCA 測(cè)定）和/或定性分析（SDS-PAGE）。
細(xì)胞裂解方案 使用組織裂解緩沖液處理細(xì)胞的說明。 • 將最多105 個(gè)細(xì)胞裝入每個(gè)測(cè)試孔中。 • 在每個(gè)測(cè)試孔中加載40 µl 組織裂解緩沖液。 • 均質(zhì)化： - 使用下頁 AFA 設(shè)置表中描述的“均質(zhì)化"AFA 條件處理測(cè)試孔。此時(shí)可以分析蛋白質(zhì)提取。將 AFA-TUBE TPX 耗材以 3,000 x g 離心 5 分鐘（平板）或 5000 x g 離心 5 分鐘（條帶）。除去上清液并將其用于定量（BCA 測(cè)定）和/或定性分析（SDS-PAGE）。
附錄 A：蛋白質(zhì)提取驗(yàn)證 可以按照這些方案進(jìn)行過程驗(yàn)證。
使用 Covaris 緩沖液的蛋白質(zhì)提取工作流程的定量性能可以使用 BCA 測(cè)定（Pierce™ BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，來自 ThermoFisher Scientific 的 PN 23227）進(jìn)行測(cè)試。建議在進(jìn)行 BCA 測(cè)定之前用去離子水將溶液按 1:5 稀釋。此外，BCA 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的不同稀釋度應(yīng)使用相同的稀釋劑（使用去離子水按 1:5 稀釋的 TLB 緩沖液）進(jìn)行。可以使用 SDS-PAGE（4-20% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel，來自 Bio-Rad 的 PN 5678093）測(cè)試定性性能。根據(jù)要求共享對(duì)照樣品的定量和定性數(shù)據(jù)。
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