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Western Blot 常見問題及解決方案

時間:2025/2/8閱讀:364
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一、背景過高

原因:

封閉不充分;一抗過濃;孵育溫度過高;一抗二抗封閉劑間有交叉反應(yīng);洗膜不充分;膜過于干燥

方案:

延長封閉時間或更換封劑;稀釋一抗;4℃孵育;加入Tween-20,以減少交叉反應(yīng);設(shè)二抗對照,稀釋二抗;增加洗膜次數(shù);避免干膜


二、無條帶或太弱

原因:

一抗二抗選擇錯誤;一抗二抗?jié)舛冗^低;一抗失效;蛋白含量過低;轉(zhuǎn)膜不充分或洗膜過度;過度封閉;二抗受疊氛鈉抑制;底物與酶失效;曝光時間過短

方案:

選擇正確抗體;檢查抗體和顯色試劑盒保質(zhì)期;提高樣品蛋白含量;設(shè)內(nèi)參對照,轉(zhuǎn)膜對照;轉(zhuǎn)膜效果的檢查;減少洗膜時間

降低封閉液濃度,減少封閉時間;延長曝光時間


三、雜帶過多

原因:

蛋白樣本具有多種修飾;蛋白樣本降解;蛋白存在二聚體或多聚體;一抗二抗?jié)舛冗^高;多克隆抗體

方案:

使用去修飾的試劑;使用蛋白酶抑制劑;電泳上樣前,煮沸10 min,以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性;降低抗體濃度;選用單克隆抗體


四、其他問題

1.背景白色條帶 → 轉(zhuǎn)膜時有氣泡或抗體分布不均

2.暗片現(xiàn)白條帶 → 一抗或二抗加入過多

3.目的條帶過低/過高 → 膠濃度不合適

4.“微笑"條帶 → 遷移過快、電泳溫度過高

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