聯(lián)系電話
上海瑋馳儀器有限公司
中級(jí)會(huì)員·6年
- 聯(lián)系人：
- 蘇小姐
- 電話：
- 400-820-3556
- 手機(jī)：
- 18521301252
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)環(huán)科路999弄浦東國際人才港13號(hào)樓2樓
- 網(wǎng)址：
- www.weichilab.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
當(dāng)前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點(diǎn)同質(zhì)化嚴(yán)重的問題，確認(rèn)疾病的作用機(jī)制并尋找的、有效的、安全的藥物靶點(diǎn)將成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施，基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。
CRISPR / Cas9已成為一種流行的基因編輯工具，因?yàn)樗子谑褂?，并且與其他基因調(diào)節(jié)工具（例如siRNA技術(shù)）相比，脫靶效應(yīng)更少。CRISPR/Cas9敲除篩選文庫的形式主要有混合文庫和陣列文庫，已被廣泛用于靶點(diǎn)識(shí)別和機(jī)制分析。雖然混合文庫的 CRISPR/Cas9 篩選通常更便宜且耗時(shí)更少，但陣列式 CRISPR/Cas9 篩選在終點(diǎn)功能分析中提供了更多的技術(shù)靈活性。此外，與混合文庫的 CRISPR 方法相比，陣列式 CRISPR/Cas9 篩選的基因型-表型相關(guān)性通常更加直接。
全基因組CRISPR篩選以識(shí)別人肝星狀細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的肝纖維化驅(qū)動(dòng)因素
題目:Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells
日期:2022-03-11
期刊:ACS Chem Biol
2022年3月11日,Takeda公司的開發(fā)團(tuán)隊(duì)在ACS Chem Biol上發(fā)表題為Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章，為了進(jìn)一步了解肝纖維化的驅(qū)動(dòng)機(jī)制，作者開發(fā)了一個(gè)高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺(tái)來鑒定肝星狀細(xì)胞(HSC)來源的TGF-β誘導(dǎo)的肝纖維化。該研究描述的功能基因組學(xué)表型篩選平臺(tái)揭示了TGF-β誘導(dǎo)的肝纖維化的新生物學(xué)機(jī)制和肝纖維化的潛在藥物靶點(diǎn)。
作者使用ACTA2蛋白表達(dá)作為HSC激活的水平，首先確認(rèn)了HSC對(duì)TGF-β的反應(yīng)，并確認(rèn)了進(jìn)行CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)染條件，包括電脈沖參數(shù)，crRNA及tracrRNA濃度，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)，鋪板密度等。
隨后按照以下工作流程使用陣列式全基因組CRISPR/Cas9進(jìn)行高通量篩選敲除潛在靶基因，通過計(jì)算ACTA2表達(dá)的抑制百分比及細(xì)胞活率，終從19,027個(gè)基因中篩選出了52個(gè)基因，其中部分基因?yàn)橐呀?jīng)被預(yù)測可以通過傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物來調(diào)節(jié)干預(yù)。
為了確認(rèn)這些基因在改善HSC纖維化方面的作用，作者在HSC中單獨(dú)敲除了這些基因，并評(píng)估這些基因的缺失對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的14種生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄譜的影響。
同時(shí)，構(gòu)建器官型肝模型進(jìn)行共培養(yǎng)，評(píng)估纖維化模型中上述基因的表達(dá)水平。與GEO profiles數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的公開可用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果進(jìn)一步支持了作者篩選的基因在肝纖維化發(fā)病過程中對(duì)HSC的潛在調(diào)控作用。
在對(duì)生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄譜影響的實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)PSMC2的缺失可以抑制多個(gè)標(biāo)志物，并進(jìn)一步確認(rèn)小分子抑制蛋白酶體活性可以解決TGF-β誘導(dǎo)的HSC活化。
隨后，作者評(píng)估了小鼠肝纖維化bacTRAP試驗(yàn)中候選基因的表達(dá)水平，確認(rèn)了這些候選基因在HSC中特異性富集。
作者還在UK Biobank上進(jìn)行了MAGMA分析，確認(rèn)部分基因的遺傳變異可能會(huì)影響NASH和肝纖維化的生物標(biāo)志物。
作者總結(jié)了這些研究的結(jié)果并對(duì)每個(gè)靶基因進(jìn)行了評(píng)分。更高的分?jǐn)?shù)表明該基因可能是肝纖維化的潛在靶標(biāo)。
總之，作者通過構(gòu)建肝纖維化的生理模型，通過高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺(tái)從19,027個(gè)基因中篩選出52個(gè)潛在基因可能在激活的HSC誘導(dǎo)的肝纖維化中起作用，通過一系列的驗(yàn)證及對(duì)比并為10個(gè)基因進(jìn)行評(píng)分，這些基因?qū)殚_發(fā)下一代肝纖維化療法提供了進(jìn)一步可能。
本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做為遞送CRISPR/Cas9的工具，在短時(shí)間內(nèi)完成全基因組CRISPR/Cas9篩選。
在近幾年的科學(xué)研究中，我們也看到了384-well Nucleofector可以很好的幫助客戶完成高通量CRISPR/Cas9篩選，siRNA篩選以及細(xì)菌的CRISPR-Prime編輯的工作中。
基于成熟的NucleofectorTM技術(shù)
快速 —— 1分鐘內(nèi)處理一個(gè)384孔板
易于使用 —— 使用現(xiàn)有的96 孔 Shuttle 方案
低材料消耗與高性能結(jié)合 —— 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)可低至2×104
自動(dòng)化兼容 —— 專為集成到液體處理平臺(tái)而設(shè)計(jì)
基于20年在外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，及的客戶反饋，Lonza開發(fā)出的4D-NucleofectorTM以靈活性和可靠性滿足客戶的需求。除384-well Nucleofector外，Lonza還可以提供不同維度的轉(zhuǎn)染模塊來應(yīng)對(duì)不同的場景需求。
