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懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時(shí)因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
一、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：
◆包含10%甘油的*培養(yǎng)基，
◆包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基，
◆50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基，或
◆50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50% 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細(xì)胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
1.懸浮細(xì)胞
●計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2.貼壁細(xì)胞
●使用分離 試劑 從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對細(xì)胞的損傷減少到zui小。
●在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
●以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。