體液外泌體(Exosome)提取試劑(包括乳汁、唾液、尿液等）

適用范圍：

1、可用于后續(xù)電鏡觀察、NanoSight納米粒度分析，加入細(xì)胞共培養(yǎng)，Western blot、ELISA、蛋白質(zhì)組學(xué)分析，小RNA提取和qPCR。

2、只需少量樣品、孵育和臺(tái)式離心，外泌體回收率穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)完整純度高。

3、媲美SBI公司ExoQuick和Invitrogen的Total Exosome Isolation外泌體分離試劑盒，是國(guó)內(nèi)性加比zui高的外泌體提取試劑盒

描述：細(xì)胞內(nèi)存在許多膜性囊泡(vesicle)結(jié)構(gòu)，可以分泌排到胞外--即外泌體(exosome)，也稱為microvesicle或microparticle--它們均可稱為extracellular vesicle。外泌體直徑約30~150 nm，攜帶多種核酸，蛋白酶、MHC、骨架蛋白、熱休克蛋白、miRNA和脂質(zhì)信號(hào)分子。外泌體分泌到細(xì)胞外基質(zhì)后，可jing血液、尿液、腦脊液、唾液、乳汁、淋巴等體液運(yùn)送到相鄰或遠(yuǎn)隔的組織細(xì)胞并被其攝取，因而在同類或不同類型的細(xì)胞間的物質(zhì)和信息遠(yuǎn)程交換中起重要作用。外泌體調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，如免疫調(diào)控、腫瘤新生和轉(zhuǎn)移，或?yàn)榧膊≡缙谠\斷標(biāo)志物，也可作為藥物載體。

外泌體分離純化的經(jīng)典方法是超速離心或密度梯度離心法，但需要超速離心機(jī)和大量樣品、操作繁瑣耗時(shí)，回收率和純度不穩(wěn)定。外泌體制備試劑盒能替代超速離心法，適應(yīng)少至100µl 的樣品，只需孵育和臺(tái)式離心，即可制備出高純度外泌體，用于后續(xù)蛋白、RNA檢測(cè)試驗(yàn)。

操作步驟

1.       樣品預(yù)處理：3000× g離心15分鐘去除細(xì)胞和碎片，上清轉(zhuǎn)移到新管用于提取外泌體。如需制備更高純度的外泌體，可用0.22µm濾膜過(guò)濾離心上清一次。

2.       每1體積的樣品，加入0.2體積的外泌體純化試劑。例如1ml樣品加0.2ml外泌體純化試劑，5ml樣品加1ml外泌體純化試劑，充分混勻。

3.       4 ºC孵育12小時(shí)，無(wú)需搖動(dòng)。注意：血清血漿富含蛋白，孵育可縮短至1個(gè)小時(shí)。

4.       1500× g離心15分鐘收集外泌體沉淀，棄上清。常溫或4 ºC離心不影響結(jié)果。

5.       1500× g再次離心5分鐘，小心吸除殘余液體，勿觸動(dòng)外泌體沉淀。

6.       加100µl PBS重懸外泌體沉淀。若初始樣品及外泌體沉淀多可多加PBS重懸。后續(xù)若進(jìn)行Western blot可直接加50-100 µl RIPA Lysis Buffer裂解外泌體。如提取RNA可在PBS重懸外泌體后，采用RNAtrip LS 液體樣品RNA提取試劑R1020提取外泌體RNA。

說(shuō)明：通常1 ml細(xì)胞培養(yǎng)上清分離的外泌體能滿足一次Western blot實(shí)驗(yàn)。外泌體常見(jiàn)標(biāo)志蛋白CD63, CD9, CD81, Tetraspani, HSP70，可用RIPA Lysis Buffer、全套Western blot試劑、Super ECL Plus超敏發(fā)光液檢測(cè)。RNAtrip LS液體樣品RNA提取試劑可純化外泌體小RNA。 

若提取外泌體用于蛋白分析，對(duì)于外泌體含量高的樣品：血清、血漿、腹水、唾液、乳汁，可采用500µL (或100-500µL)的初始樣品量，再加入等體積的預(yù)冷PBS緩沖液稀釋混勻，然后根據(jù)稀釋后的終體積，再加入0.2體積的外泌體提取試劑。對(duì)于外泌體含量較低的樣品：組織塊培養(yǎng)上清、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液、腦脊液，可采用1 ml樣品體積，不用PBS稀釋，處理后直接加入提取試劑。若提取的外泌體用于小RNA和qPCR分析，建議采用較大體積的樣品，例如5-10ml。

采用EDTA而非肝素抗凝血，以免影響后續(xù)PCR。