2022年，哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Science期刊關(guān)于微生物群落研究方法學(xué)重要突破的研究成果宣告微生物單細(xì)胞時(shí)代正式開啟[1]。
這個(gè)在近年國自然基金項(xiàng)目中也被屢屢點(diǎn)名的微生物單細(xì)胞基因組學(xué)(SCG)提供了獲取稀有和暫無法培養(yǎng)微生物基因組的途徑微生物基因組學(xué)是宏基因組學(xué)的補(bǔ)充方法。由于單個(gè)微生物細(xì)胞中的基因組含量在飛克水平，如需進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification, WGA)，則最常見的WGA方法是單個(gè)微生物細(xì)胞基因組多重置換擴(kuò)增法(multiple displacement amplification, MDA)，但該方法的成本昂貴，并且其對特定基因組區(qū)域的偏向性會(huì)降低高通量擴(kuò)增效率，導(dǎo)致基因組擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋不均勻。因此，獲得高質(zhì)量細(xì)分細(xì)菌種群，特別是微生物群落中的少數(shù)成員的全基因組信息變得異常困難。
圖1. 不同的微生物單細(xì)胞基因組測序方法比較
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不同通過減少微生物單細(xì)胞測序反應(yīng)體系總體積的方法比較
過往的研究發(fā)現(xiàn)減少WGA反應(yīng)體系總體積的微縮化方法已被證明可以增加模板的濃度，并減少背景污染被放大的機(jī)會(huì)，改善微生物基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的基因組覆蓋率和序列偏好均勻性的挑戰(zhàn)。如今，反應(yīng)體積微縮化理念的方法已應(yīng)用于各種不同的單細(xì)胞基因測序微流控裝置。
圖 2. 顏色代碼表示不同微流控裝置的相對優(yōu)勢，從綠色(優(yōu)勢較強(qiáng)) 到橙色，再到紅色(優(yōu)勢較小)。
Volume reduction approach: 反應(yīng)體系微縮化方法;
Cell throughput: 細(xì)胞檢測通量;
Scale-up Flexibility: 反應(yīng)體積放大靈活性;
Average Costs: 平均使用成本 ;
Fabrication complexity:操作復(fù)雜度
然而，并不是每一家實(shí)驗(yàn)室都能自主研發(fā)或者具備一套以上原理的商業(yè)化系統(tǒng)，且這些系統(tǒng)擅長的應(yīng)用場景是真核單細(xì)胞測序[2]。為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，在一項(xiàng)富有創(chuàng)意的微生物單細(xì)胞基因組測序方法學(xué)改良前沿研究中，德國卡爾斯魯厄理工大學(xué)的研究人員知難而上，借助I.DOT MINI非接觸式自動(dòng)化微量分液系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)納升級極限分液體積的性能，提出并證實(shí)了一種通過大幅減少基因組測序反應(yīng)體系的MDA改良方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該微縮化方法不但可以顯著降低測序成本，同時(shí)提高了常規(guī)384孔板中微生物基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的基因組覆蓋率和序列偏好均勻性。
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改良的微縮化微生物單細(xì)胞基因組測序MDA法流程
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A
環(huán)境微生物樣品應(yīng)立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理或利用冷凍保護(hù)劑深度冷凍以保持細(xì)胞的完整性
B
細(xì)胞通常用非特異性熒光染料染色，如DAPI或SYBR®Green或其他特異性標(biāo)記如FISH
C
利用平臺(tái)或單個(gè)實(shí)驗(yàn)室常見的單細(xì)胞分離技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞物理分離到多孔板中
D
使用堿性緩沖液和凍融循環(huán)的組合將單個(gè)細(xì)胞裂解釋放基因組DNA
E
由于一個(gè)典型的原核微生物細(xì)胞只含極微量的飛克級基因組DNA，因此需要全基因組擴(kuò)增(WGA)來產(chǎn)生足夠數(shù)量的DNA以制備文庫
F
一旦DNA文庫準(zhǔn)備好，可以分別使用短讀長和/或長讀長基因組測序平臺(tái)進(jìn)行測序
G
最后利用生物信息學(xué)對序列進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)、裝配、分類、ORF調(diào)用和注釋
在以上微生物單細(xì)胞基因組測序MDA改良法步驟中：
I.DOT MINI非接觸式微量分液系統(tǒng)將微量裂解液分配到含細(xì)胞和不含細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中(陰性對照)。在21℃下孵育10分鐘后再加入等體積的中和緩沖液。
在WGA測序文庫制備體系的步驟中，利用I.DOT MINI將測序反應(yīng)主混合液(MasterMix)以nL至uL級的梯度分液體積分配到含裂解細(xì)胞孔和負(fù)對照孔，這樣最后的MDA反應(yīng)總體積呈現(xiàn)為梯度的nL至uL級總體積500nL, 800nL, 1.0uL, 1.25uL, 5uL, 10uL。這些MDA反應(yīng)體系在PCR儀中進(jìn)一步孵化即得到擴(kuò)增后的微生物單細(xì)胞基因組DNA模板用于測序文庫準(zhǔn)備。
3
改良的MDA法單細(xì)胞基因組測序結(jié)果
圖3. 改良MDA微生物單細(xì)胞測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)
與WGA-X™等現(xiàn)有的方法相比，改良型MDA的微生物單細(xì)胞基因組覆蓋率取得了很大改進(jìn)，以僅僅1.25uL反應(yīng)體系的reads覆蓋了大腸桿菌基因組的85±13%，比其他總反應(yīng)體積多覆蓋19% ~ 40%。在未改進(jìn)的WGA-X™方法體系下10uL反應(yīng)體系得到了36±21%的覆蓋率，與本改良方法中的10uL反應(yīng)相比，改良方法比未改進(jìn)方法的覆蓋廣度增加了約19%。這些結(jié)果表明，在1.25uL反應(yīng)體積下進(jìn)行的MDA大大改進(jìn)了該方法，與標(biāo)準(zhǔn)的、更大的反應(yīng)體積相比，可以產(chǎn)生更少的基因組偏差、更少的樣品污染和更完整的微生物基因組覆蓋度。
改良的反應(yīng)體積微縮化MDA微生物單細(xì)胞基因組測序方法使得研究者僅需使用普通384孔板以及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)可用的單細(xì)胞分選設(shè)備，聯(lián)合I.DOT MINI非接觸式納升級微量分液系統(tǒng)的極限微量分液能力即可輕松實(shí)現(xiàn)。從未改良的標(biāo)準(zhǔn)50uL MDA反應(yīng)中大幅降低了約97.5%的成本。另一方面，與微生物單細(xì)胞基因組測序通常使用的不低于100x測序深度相比，使用改良的測序反應(yīng)體積微縮化的方法僅需40x測序深度便可實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的微生物單細(xì)胞全基因組序列組裝。這種成本更為友好的改良型WGA-X™方法或?qū)⑦€有進(jìn)一步降低成本的空間，激發(fā)更多科學(xué)家發(fā)起探索環(huán)境中稀有分類微生物群體和未知新型微生物基因組信息潛力的前沿研究。
-參考文獻(xiàn)-
[1] High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome, Science, 2022
[2] A simplified improvement to multiple displacement amplification for microbial single-cell genomics, Int J Mol Sci, 2023
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