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解析｜高通量測(cè)序技術(shù)是如何應(yīng)用于新冠病毒研究的
新型冠狀病毒肺炎確診人數(shù)還在增加，疫情牽動(dòng)人心，截止到2月13日16:00，全國已有確診病例59888例，疑似病例16067例。
高通量測(cè)序技術(shù)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)，以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長較短等為標(biāo)志。因其高通量、不依賴于已知核酸序列和具有更高的靈敏度，在新型冠狀病毒的鑒定、分型、溯源、診斷等方面都展現(xiàn)了重要作用。我們現(xiàn)羅列疫情以來，NGS技術(shù)在新冠病毒研究方面的應(yīng)用，以饗讀者。
一、NGS應(yīng)用于COVID-19的病原鑒定
2019年12月中旬以來，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、中國科學(xué)院武漢病毒研究所[1]、中國疾控中心、山東第—醫(yī)科大學(xué)、湖北省疾控中心等機(jī)構(gòu)都先后通過全基因組測(cè)序等技術(shù)，獲得了病毒全基因組序列，確認(rèn)了病原為以前未知的 β 冠狀病毒。中國于1月10日公布了新冠狀病毒的完整基因組序列。NGS在新型冠狀病毒的鑒定中發(fā)揮了重要作用。
二、NGS應(yīng)用于COVID-19的病毒溯源
中國疾控中心、山東第—醫(yī)科大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與2018年在中國東部舟山發(fā)現(xiàn)的兩種蝙蝠相關(guān)冠狀病毒ZC45和ZXC21密切相關(guān)，同源性約為88%。相比之下，SARS-CoV-2與SARS-CoV和MERS-CoV的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，同源性分別為79%和50%[2]（圖1）。
圖1.SARS-CoV-2及β冠狀病毒屬代表性病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析。（圖片來自原文）
石正麗團(tuán)隊(duì)對(duì)5位患者肺泡灌洗液進(jìn)行 mNGS 測(cè)序，87.1%的去人源后 reads 比對(duì)，之后用 targeted PCR 和從頭組裝得到完整的SARS-CoV-2病毒全長序列（29891 bp），整個(gè)序列與 SARS-CoV 的相似性在79.5%[3]。2月7日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)*網(wǎng)站發(fā)布消息稱，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室分析了1000多份宏基因組樣品，發(fā)現(xiàn)穿山甲分離到的病毒株與目前感染人的毒株序列相似度高達(dá)99%。提示穿山甲為此次新型冠狀病毒潛在中間宿主。NGS為揭示病毒傳播途徑與追溯傳染源頭提供支撐。
三、NGS應(yīng)用于COVID-19的病原學(xué)診斷
基因測(cè)序是能夠動(dòng)態(tài)追蹤病毒變異的唯—方法。高通量測(cè)序通過文庫制備、上機(jī)測(cè)序與數(shù)據(jù)比對(duì)分析，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒是否變異。新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》闡述的病例確診方式就包括“呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒基因測(cè)序，與已知的新型冠狀病毒高度同源”，相較于RT-PCR檢測(cè)，基因測(cè)序能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病毒變異，在準(zhǔn)確性和通量上也具有優(yōu)勢(shì)。
翊圣生物提供NGS建庫解決方案
考慮到病原體隨時(shí)會(huì)有變異可能以及陽性檢出率問題，NGS技術(shù)無疑會(huì)彌補(bǔ)這一缺陷，制備高質(zhì)量的RNA文庫至關(guān)重要，翊圣生物深耕NGS多年，可以提供基于MGI & Illumina平臺(tái)的高效建庫試劑盒。
依據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)流程，翊圣生物提供以下三種解決方案
總RNA建庫方法
試劑類別 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
核糖體去除 | Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) MaxUp | 12253ES |
Hieff NGS® RNA Cleaner | 12602ES | |
華大平臺(tái) RNA建庫 | Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for MGI® | 13345ES |
Illumina平臺(tái) RNA建庫 | Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for illumina® | 12251ES |
先反轉(zhuǎn)后DNA建庫方法
試劑類別 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
逆轉(zhuǎn)錄酶 | Hieff NGS® Dual-mode cDNA Systhesis Kit | 12250ES |
華大平臺(tái) 酶切法建庫 | Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI® | 13321ES |
Illumina平臺(tái) 酶切法建庫 | Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for illumina | 12204ES |
RNA轉(zhuǎn)座酶建庫方法
試劑類別 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
逆轉(zhuǎn)錄酶 | Hifair® IV Reverse Transcriptase 第四代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶 | 11112ES |
TN5建庫 | Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12206ES |
配套試劑
試劑類別 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
環(huán)化試劑盒 | Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI® | 13341ES |
華大平臺(tái) 接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI®, Set 1,2,3 | 13360ES- 13362ES |
Illumina平臺(tái) 單端接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1,2,3,4 | 12615ES- 12618ES |
Illumina平臺(tái) 雙端接頭 | Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 1,2 | 12613ES- 12614ES |
DNA磁珠 | Hieff NGS® DNA Selection Beads | 12601ES |
Qubit試劑 | dsDNA HS Assay Kit for Qubit | 12640ES |
參考文獻(xiàn)
- Zhu N, et al. A Novel Coronavirusfrom Patients with Pneumonia in China. The New England Journal of Medicine ,2019. DOI: 10.1056/NEJMoa2001017
- rof Roujian Lu, MSc * Xiang Zhao, MD * Juan Li, PhD * Peihua Niu, PhD * Bo Yang, MSc * Honglong Wu, MSc * et al. Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding,2020.DOI:
- Zhou P, et al. Discovery of a novel coronavirusassociated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential batorigin. bioRxiv, 2020. doi:
