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瘋牛病夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法
閱讀：732 發(fā)布時(shí)間：2011-1-4本方法（PLAIA ELISA）是一種快速、準(zhǔn)確性高的瘋牛病篩選方法之一，1999年通過(guò)歐盟認(rèn)證。該方法具有反應(yīng)時(shí)間短、成本低、反應(yīng)步驟少的特點(diǎn)。瘋牛病夾心ELISA是法國(guó)原子能委員會(huì)（FrenchAtomicEnergyCommission）研制出來(lái)的一種診斷瘋牛病的快速方法，現(xiàn)被美國(guó)Bio-Rad公司收購(gòu)。該方法又稱(chēng)PLAIA~BSE試驗(yàn)，它由兩種試劑盒組成，即BSE純化試劑盒和BSE檢測(cè)試劑盒。本方法的原理是用BSE純化試劑盒中的試劑和蛋白酶K對(duì)牛腦腦干部的朊毒體進(jìn)行消化、純化、濃縮和溶解。BSE檢測(cè)試劑盒是用兩種單抗通過(guò)免疫酶技術(shù)對(duì)異常PrP進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，本試劑盒可檢測(cè)180個(gè)樣本。酶標(biāo)板有12X8個(gè)孔，每孔包被有一抗（PrP單抗），同時(shí)另一單抗標(biāo)記了過(guò)氧化物酶。反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)定樣本的OD值判定結(jié)果。
本方法的耗時(shí)約為5h，特異性和敏感性均為100％。
瘋牛病夾心ELISA檢測(cè)方法的主要步驟如下。
（1）BSE病原純化 從腦閂部?。?50±40）mg神經(jīng)組織。將樣品轉(zhuǎn)移到研磨管，用專(zhuān)配的細(xì)胞破碎儀勻漿一個(gè)循環(huán)45s。當(dāng)研磨不充分時(shí)，可以多做1-2個(gè)循環(huán)，但注意在每個(gè)循環(huán)之間要保持管子的溫度在室溫或4~C。取勻漿液500~L樣品轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中。取500~L配好的PK酶溶液加到離心管中，混 勻并在（37土1）℃下水浴或恒溫箱內(nèi)孵育。在離心管中加入500~L試劑B，混勻直至均一的藍(lán)色。在室溫下20000g離心5min或15000g離心7rain。棄去上清液，然后用吸水紙吸干每一管。在每管中加入50t~L試劑CI， （100土1）℃下孵育（5i1）min，然后在每管中加入250gL試劑R6。
（2）BSE病原檢測(cè) 以下面的順序在各孔中加入相應(yīng)溶液：A1、B1、C1、D1加入100ml+陰性對(duì)照液R3；E1、P1加入100~L陽(yáng)性對(duì)照液R4；G1、H1等加入100uL已稀釋的樣品溶液。蓋上密封膜在（37土1）℃下孵育（75土15）min。洗完板后在每孔中加入100~L酶標(biāo)一抗，蓋上密封膜并在2～8~C下孵育（60±5）min。洗完板后在每孔中加入100~L顯色液并在室溫下暗處孵育30min。與加顯色液的順利一致在每孔中依次加入100pL終止液。在終止反應(yīng)后擦干酶標(biāo)板的底部，在30min內(nèi)用測(cè)量值為450nm，參考值為620nm處讀數(shù)，得到各孔的OD值。
（3）結(jié)果分析 當(dāng)有一個(gè)陰性對(duì)照的OD值在正常范圍之外或超出OD平均值的40％，則該值視為脫離正軌的值，要淘汰，然后重新計(jì)算其他三個(gè)陰性對(duì)照的OD平均值，將此值作為本實(shí)驗(yàn)的CUT-OFF值。如果有兩個(gè)或更多的陰性對(duì)照OD值在正常范圍之外或超出OD平均值的40％，則重做實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照的OD值必須大于或等于1．0。
若樣品的OD值小于CUT-OFF值則樣品視為陰性。當(dāng)然，如果樣品的OD值剛剛低于CUT-OFF值（差值小于CUT-OFF值的10％），則該結(jié)果要慎重考慮，并且相應(yīng)的樣品需重新實(shí)驗(yàn)。若樣品的OD值大于或等于CUT-OFF值，則初次判定為陽(yáng)性，并需重新實(shí)驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)樣品的OD值還是大于或等于CUT-OFF值，則判為陽(yáng)性。若重新實(shí)驗(yàn)后樣品的OD值低于CUT-OFF值則需用其他方法（如免疫組織化學(xué)或免疫印跡方法）進(jìn)行確診。若重新實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是剛剛低于CUT-OFF值，則也需用其他方法（如免疫組織化學(xué)或免疫印跡方法）進(jìn)行確診。