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蛋白質(zhì)純化離子交換法
閱讀：1016 發(fā)布時(shí)間：2011-1-4各種蛋白質(zhì)分子上可能帶有不同的電性，經(jīng)過離子交換管柱，可依其分子帶電性的差異而分離開來 （Pharmacia 操作手冊(cè), Ion Exchange）。
儀器設(shè)備：
塑料管柱 （Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm）
分劃收集器 （fraction collector, 另需準(zhǔn)備干凈試管約60 支）
濃縮用離心機(jī) （低速5,000 rpm） 及濃縮離心管Centriplus
藥品試劑：
DEAE Sephacel （膠體體積約15 mL，預(yù)先以緩沖液Buffer A-0 平衡好）
Buffer A-0 （如上述配法）
Buffer A-300 溶離液：Buffer A-0 加有0.3 M NaCl
Buffer A-500 溶離液：Buffer A-0 加有0.5 M NaCl
方法步驟：
1） 將Econo-Pac 管柱架好，并將三向閥及軟管等組合完成。
2） 震蕩DEAE Sephacel 膠體使的懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢沈降，在沈降過程中隨時(shí)加入buffer A-0，勿使膠體干掉。
3） 待膠體沈降*后，高度應(yīng)在15 cm 左右。膠柱以buffer A-0 一直流洗，流速快慢可以不考慮；連接好收集器，每試管收2.5 mL。離子交換法的膠體平衡極為重要，可測(cè)流出液的pH 或離子濃度，看是否與buffer A-0 相同，若不一樣則需要再流洗的。
4） 樣本的添加方法同上述膠體過濾法，并啟動(dòng)分劃收集器開始收集，當(dāng)樣本全部沒入膠體后，再加入同體積buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后，去除膠體上方的緩沖液，但勿使膠體干掉。
5） 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶離的，每批次流洗各50 mL，注意更換濃度時(shí)，膠體上方勿殘存上一種溶液。
6） 收集所有分劃，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS 活性測(cè)定，結(jié)果作圖。
7） 收集GUS 活性區(qū)，并以Centriprep-30 濃縮至 _______ mL （IEX），記得要保留100 μL。
8） 離子交換膠體以buffer A-0 洗過50 mL 后，收起來交回。