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CLOVER TC-M160 Pro霉菌毒素多功能凈化柱
飼料中黃曲霉，玉米赤霉烯酮和T-2毒素的測定
--－LC-MS法
1.使用對象
本方法參考NY/T2071-2011，試樣中的黃曲霉毒素，玉米赤霉烯酮和T-2毒素經(jīng)乙腈溶液提取，正己烷脫脂及多功能凈化柱凈化后，氮氣吹干，甲酸乙腈溶液溶解，液質(zhì)法測定。
本方法黃曲霉毒素與T-2毒素的檢測限為1.0ug/kg，定量限為2.0ug/kg；玉米赤霉烯酮的檢測限為5.0ug/kg，定量限為10.0ug/kg。
GB13078-2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：
黃 曲 霉 毒 素 B1 ug/kg | 飼料 原料 | 種類 | *（ug/kg） | 方法 |
玉米加工產(chǎn)品，花生餅（粕） | ≦50 | NY/T 2071 | ||
植物油脂（玉米油，花生油除外） | ≦10 | |||
玉米油，花生油 | ≦20 | |||
其他植物性飼料原料 | ≦30 | |||
飼料 產(chǎn)品 | 仔豬，雛禽濃縮飼料 | ≦10 | ||
肉用仔鴨后期，生長鴨，產(chǎn)蛋鴨濃縮飼料 | ≦15 | |||
其他濃縮飼料 | ≦20 | |||
犢牛，羔羊精料補充料 | ≦20 | |||
泌乳期精料補充料 | ≦10 | |||
其他精料補充料 | ≦30 | |||
仔豬，雛禽配合飼料 | ≦10 | |||
肉用仔鴨后期，生長鴨，產(chǎn)蛋鴨配合飼料 | ≦15 | |||
其他配合飼料 | ≦20 |
玉 米 赤 霉 烯 酮 mg/kg | 飼料 原料 | 種類 | *（mg/kg） | 方法 |
玉米及其加工產(chǎn)品(玉米皮，噴漿玉米皮，玉米漿干粉除外) | ≦0.5 | NY/T 2071 | ||
玉米皮，噴漿玉米皮，玉米漿干粉，玉米酒糟類產(chǎn)品 | ≦1.5 | |||
其他植物性飼料原料 | ≦1 | |||
飼料 產(chǎn)品 | 犢牛，羔羊，泌乳期精料補充料 | ≦0.5 | ||
仔豬配合飼料 | ≦0.15 | |||
青年母豬配合飼料 | ≦0.1 | |||
其他豬配合飼料 | ≦0.25 | |||
其他配合飼料 | ≦0.5 |
T-2 毒 素 mg/kg | 種類 | *（mg/kg） | 方法 |
植物性飼料原料 | ≦0.5 | NY/T 2071 | |
豬，禽配合飼料 | ≦0.5 |
2.實驗準(zhǔn)備
2.1溶液配制
甲酸溶液（0.1%）：準(zhǔn)確量取甲酸1ml，加水至1000ml，搖勻即得。
乙酸溶液（0.02%）：準(zhǔn)確量取冰乙酸0.2ml，加水至1000ml，搖勻即得。
甲酸乙腈溶液：取甲酸溶液50ml，加乙腈至100ml，搖勻即得。
2.2混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：
分別吸取一定量的6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，用甲醇配成濃度為1ug/ml的混合儲備液，保存于4℃冰箱中。
2.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：
分別吸取一定量的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，添加空白樣品提取液，氮氣吹干后，用流動相稀釋成濃度為1.0ug/L,5.0ug/L,10.0ug/L,50ug/L,100ug/L,200ug/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用新配。
3.樣品的前處理
（1）稱取5g±0.02g飼料樣品于50ml離心管中，準(zhǔn)確加入25ml提取液（乙腈：水=84：16），渦旋混勻2min，置于超聲波清洗器中超聲提取20min，中間振蕩2-3次。
（2）取出，于8000r/min離心5min，傾出上清液至分液漏斗中，加入15ml正己烷，充分振蕩。待靜止分層后，準(zhǔn)確量取下層液5ml，待用。
（3）將上述5ml液體，過多功能凈化柱，控制流速為2ml/min，收集流出液，在60℃氮氣下吹干。
（4）用1.0ml甲酸乙腈溶液溶解殘渣，渦旋30s，經(jīng)0.22um濾膜過濾后，上機檢測。
4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
4.1液相色譜條件
色譜柱： C18柱,3.0×150mm（3.0um）；或其他等效色譜柱。
柱溫：33℃
進樣量：20ul
流動相，流速見下表。
a.ESI+源梯度洗脫條件
時間，min | 流速，mL/min | 甲酸溶液，% | 甲醇/乙腈（1：1） | 曲線（curve） |
0 | 0.3 | 70 | 30 | 1 |
4.0 | 0.3 | 55 | 45 | 6 |
14.0 | 0.3 | 0 | 100 | 6 |
15.0 | 0.3 | 0 | 100 | 6 |
15.1 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
a.ESI-源梯度洗脫條件
時間，min | 流速，mL/min | 乙酸溶液，% | 甲醇/乙腈（1：1） | 曲線（curve） |
0 | 0.3 | 70 | 30 | 1 |
8.0 | 0.3 | 10 | 90 | 6 |
13.0 | 0.3 | 10 | 90 | 6 |
13.1 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
20.0 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
4.2 質(zhì)譜條件
a離子源：電噴霧離子源。
b掃描方式：正離子掃描模式和負離子掃描模式。
c檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測。
d脫溶劑氣，錐孔氣均為高純氮氣，碰撞氣為高純氬氣，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。
e毛細管電壓，錐孔電壓，碰撞能量等電壓值應(yīng)優(yōu)化至靈敏度。
f定性離子對，定量離子對，保留時間及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量參考值見下表
a.ESI +監(jiān)測模式
真菌毒素名稱 | 保留時間min | 定性離子對m/z | 定量離子對m/z | 錐孔電壓V | 碰撞能量eV |
黃曲霉毒素B1 | 13.7 | 313.1>241.1 313.1>285.1 | 313.1>241.1 | 39 | 32 20 |
黃曲霉毒素B2 | 13.2 | 315.1>259.1 315.1>287.0 | 315.1>259.1 | 44 | 28 24 |
黃曲霉毒素G1 | 12.6 | 329.0>243.1 329.0>283.1 | 329.0>243.1 | 40 | 26 24 |
hunag曲霉毒素G2 | 12.0 | 331.0>245.1 331.0>217.1 | 331.0>245.1 | 42 | 32 20 |
T-2毒素 | 16.0 | 489.1>245.2 489.1>387.1 | 4489.1>245.2 | 38 | 25 21 |
b.ESI-監(jiān)測模式
真菌毒素名稱 | 保留時間min | 定性離子對m/z | 定量離子對m/z | 錐孔電壓V | 碰撞能量eV |
玉米赤霉烯酮 | 13.4 | 317.0>175.1 317.0>273.1 | 317.0>175.1 | 40 | 26 26 |
5.定性測定
在相同實驗條件下，樣品中待測物質(zhì)保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的偏差不超過標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的±2.5%，且樣品中各祖墳定性離子的相對豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過下表的范圍，可判定樣品中存在對應(yīng)的待測物。
定性確證時相對離子豐度的大允許偏差（%）
相對離子豐度 | >50 | >20-50 | >10-20 | ≦10 |
允許的大偏差 | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
6.定量測定
在儀器工作條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液與試樣交替進樣，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正，外標(biāo)法定量。
CLOVER TC-M160 Pro霉菌毒素多功能凈化柱
品牌：科樂福clover
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